药物在不同患者中疗效差异显著，这不仅与基因变异有关，还源于蛋白质层面的微小变化。基因可通过剪接和翻译后修饰生成多种蛋白质异构体（Proteoforms），这些异构体直接影响药物靶向和疗效。然而，传统研究多聚焦单一蛋白质，忽视了异构体的关键作用，尤其在无基因突变时，其重要性更为凸显。要全面理解药物机制及副作用，亟需精准工具揭示蛋白质异构体的复杂性，为精准医学开辟新路径。
同一蛋白不同异构体（proteoform）对药物的敏感性差异
伊布替尼（Ibrutinib）是一种用于治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL）等疾病的布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂。尽管其主要靶点是BTK，但临床观察显示，伊布替尼的疗效和毒性可能与多种非靶标作用有关。
热蛋白质组分析（TPP）通过质谱方法和多温度点的精细描绘，能够高通量鉴定药物靶点和脱靶点，还可以在无先验知识的前提下区分变构体的差异（Western Blot需要预先知道目的蛋白的修饰差异）。通过TPP技术，研究者可以在细胞内系统性分析伊布替尼可能影响的其他蛋白质形式和生物学过程，从而更全面地揭示其作用机制。
2025年2月25日，热蛋白质组学开发者团队成员，瑞典卡罗林斯卡学院Rozbeh Jafari团队在期刊Nat Commun（IF=14.7）上发表了题为“Functional proteoform group deconvolution reveals a broader spectrum of ibrutinib off-targets”的研究论文，该研究利用热蛋白质组学（TPP）探究伊布替尼治疗白血病（CLL）的靶点及脱靶点，并通过蛋白异构体研究揭示了伊布替尼对特定蛋白变体的特异性结合及其生物学效应。这些发现不仅扩展了对伊布替尼作用机制的理解，还为精准医学和药物开发提供了重要的理论依据和技术支持[1]。
细胞系样本：RCH-ACV（前体B细胞急性淋巴细胞白血病细胞系）和SW13（肾上腺皮质癌细胞系）的裂解液用于TPP实验，设置Ibrutinib处理组和DMSO对照组。
CLL样本：68例CLL患者的外周血临床样本用于质谱分析，以评估功能蛋白质形式分组在临床治疗中的变化，设置Ibrutinib治疗组和未治疗组。
功能性蛋白异构体组分析：通过TPP系统分析ibrutinib的靶点和脱靶点，揭示其广泛作用机制。
蛋白异构体药物敏感性差异发现：ibrutinib对BRAF、YES1的特定异构体组具有特异性结合，揭示更细致的药物机制。
临床样本验证：在CLL患者中，蛋白异构体组丰度变化（如WASHC2C_1）与治疗反应相关，解释敏感性与耐药性。
高剪接亚组独特发现：在ASB-CLL亚组中，识别与ibrutinib敏感性相关的异构体组（如BZW2_2），为治疗策略提供新思路。
通过热蛋白质组分析（TPP），研究团队在ibrutinib处理的细胞裂解物中成功识别了16079个功能性蛋白异构体组。这些蛋白异构体组在热稳定性上表现出显著差异，尤其是在ibrutinib处理与未处理的条件下。研究不仅验证了ibrutinib的已知靶点，如BTK（Bruton酪氨酸激酶），还发现了新的潜在靶点，这些靶点涉及高尔基体运输、糖基化、细胞粘附和内体处理等功能。这些新靶点的发现提示，ibrutinib可能通过这些蛋白异构体组在免疫调节和细胞过程调控中发挥更广泛的作用。
ibrutinib的结合可能引发蛋白质的构象变化或变构效应，进而改变靶点与其结合伙伴之间的相互作用。通过过度表达分析（ORA），研究团队识别了多个受ibrutinib影响的蛋白质复合物，包括CORVET、HOPS和NUMAC复合物。这些复合物在细胞中参与多种关键过程，如膜运输、信号传导和染色质重塑，表明ibrutinib可能通过调控这些复合物的功能来发挥其生物学效应。
通过分析BRAF和YES1的功能性蛋白异构体组，研究发现ibrutinib对某些异构体组具有特异性结合。BRAF的两个异构体组（BRAF_1和BRAF_2）在ibrutinib处理下热稳定性不同，提示其可能以不同构象存在。YES1的两个异构体组（YES1_1和YES1_2）也表现出不同热稳定性，表明其N端调控区域（SNRE）可能影响ibrutinib结合。这些结果表明，蛋白异构体组分析能更细致地揭示药物结合特性，而基因水平分析可能掩盖这些差异。
通过pull-down实验，研究团队验证了TPP识别的部分ibrutinib靶点，包括WASH复合物的WASHC2C_1、BTK的两个功能性蛋白异构体组（BTK_1和BTK_2）、src激酶家族成员FYN_1以及RAF激酶家族成员BRAF_1。这些结果进一步证实了功能性蛋白异构体组分析的可靠性，并支持ibrutinib通过影响特定蛋白异构体组来发挥其生物学效应的假设。
在慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者队列中，研究团队发现功能性蛋白异构体组的丰度变化与ibrutinib治疗状态密切相关。例如，WASHC2C_1在ibrutinib治疗的患者中丰度显著降低，而WASHC2C_2则无明显变化。这些变化可能揭示了治疗敏感性和耐药性的潜在机制，并提示ibrutinib可能通过调控特定蛋白异构体组的丰度来发挥其治疗效果。
在剪接体活性增强的CLL患者亚组（ASB-CLL）中，研究团队识别了一些与ibrutinib体外敏感性相关的功能性蛋白异构体组。例如，BZW2_2的丰度与ibrutinib的体外敏感性显著相关，提示该蛋白异构体组可能在ibrutinib的耐药性中起关键作用。这些发现有助于解释该亚组患者对ibrutinib的较差反应，并为未来的治疗策略提供新的思路。
TPP作为高通量检测蛋白异构体药物敏感性差异的蛋白质组学工具，揭示了伊布替尼的更广泛靶点谱，还解析了蛋白质复合物和异构体组的动态变化。这些发现为理解药物的作用机制、优化治疗方案以及推动精准医学的发展提供了重要的理论依据和技术支持。
